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    Robert     

Claude Robert, Ph.D.

Université Laval

Département des sciences animales

Centre de recherche en biologie de la reproduction

Faculté des sciences de l'agriculture et de l'alimentation

Pavillon Paul-Comtois, local 4221

Université Laval (Québec) G1K 7P4

Phone: (418) 656-2131 poste 12842

Fax: (418) 656-3766

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Research Interests: 

Translation to come

Mon programme de recherche s’intéresse à comprendre les mécanismes fondamentaux associés au développement embryonnaire précoce. Ainsi, chez plusieurs espèces d’oiseaux, d’amphibiens et de grands mammifères, les premières divisions cellulaires s’effectuent en absence d’activité transcriptionnelle nucléaire. En effet, les premiers blastomères ne transcrivent pas leur génome et la production de protéine est soutenue par les ARN messagers stockés durant l’ovogenèse. Ce stockage demande une gestion précise pour la stabilisation des messagers « dormants », pour le recrutement de ceux à traduire et même pour la destruction d’un grand nombre de ces ARNm stockés qui ne seront jamais traduits. Ces mécanismes sont encore très peu élucidés et puisque la grande majorité de la mortalité embryonnaire s’effectue avant la période d’activation du potentiel transcriptionnel des cellules embryonnaires, une de nos hypothèses de travail est que ces mécanismes sont, du moins en parti, responsables de la compétence développementale du jeune embryon. Ainsi, une bonne part des travaux effectués dans mon laboratoire touche la gestion des ARN durant la période de développement précoce couvrant la maturation de l’ovocyte jusqu’au stade de blastocyste.

Le recensement du transcriptome embryonnaire par séquençage à haut débit a permis de confirmer la présence et l’importante abondance de longs ARN non-codants intergéniques. Nous travaillons présentement à classer ces transcrits en fonction de certains motifs connus et nous caractérisons leur présence à différents stades de développement. L’impact du stress causé par le microenvironnement dans lequel l’embryon croît sur l’expression de ces ARNlinc est également à l’étude. Nous nous penchons également sur l’expression de ces candidats en fonction de l’état de méthylation de l’ADN.

Pour étudier les mécanismes de gestion des ARN, nous utilisons une approche par candidats dont la présence des transcrits a été confirmée dans les jeunes embryons. Nous visons à approfondir les connaissances d’une famille de protéines : les membres de la famille du « fragile-X mental retardation related proteins » dont FMR1 en est le membre central. Notre hypothèse est que les membres de la famille FMRP seraient impliqués dans le transport et le contrôle de la traduction des ARNm stockés. Présentement, nous visons à caractériser la fluctuation de leur abondance au cours de la maturation ovocytaire ainsi que durant le développement précoce. Nous cherchons présentement à déterminer s’il est possible que certains ARNm soient transférés de la corona radiata vers l’ovocyte grâce au transport effectué par les FMRP. Nous étudions leur localisation intracellulaire et l’impact de leur absence lorsque l’ARN correspondant est spécifiquement dégradé grâce à l’injection d’ARN interférentiels.

Nous avons également choisi d’étudier les mécanismes impliqués durant la période d’activation du génome embryonnaire qui s’effectue au stade de 8-cellules chez le bovin (contrairement à 1-cellule chez la souris). Pour ce faire, nous caractérisons les ARNm en voie de traduction dans les stades avoisinants la transition maternelle-embryonnaire. Le développement d’une méthode d’isolation des polyribosomes nous permet d’interroger différents stades développementaux et de contraster les ARNm qui sont traduits avant, pendant et après l’activation du génome embryonnaire. Notre hypothèse est que ces comparaisons nous permettront d’identifier les protéines impliquées dans cette étape cruciale du développement. Cette connaissance nous permettra de brosser un portrait général de ce qui se passe pour ensuite cibler l’étude de ces mécanismes en étudiant certaines protéines clés.

D’un point de vue plus appliqué, mon programme de recherche s’intéresse également à plusieurs aspects visant à mesurer les impacts de facteurs de stress ou d’ordre génétiques sur l’expression du jeune embryon. Nous avons comparé l’expression génique de blastocystes produits dans différentes conditions impliquant la procédure de stimulation ovarienne et/ou les conditions de production embryonnaires in vitro. Nous travaillons actuellement à déterminer l’impact du niveau de consanguinité sur l’expression du jeune embryon ce qui pourrait expliquer en partie la baisse du succès reproductif des vaches laitières et nous nous penchons sur une particularité de race alors que des différences quant à la qualité embryonnaire ont été observées mais peu documentées entre les Jersey et les Holstein. Notre hypothèse étant que le métabolisme énergétique des embryons Jersey diffère de celui de la Holstein, nous étudions l’abondance et la distribution des lipides de même que nous caractérisons différents paramètre mitochondriaux (e.g. potentiel membranaire, quantité, distribution, concentration d’ADN mitochondrial, etc.).

 

Summary of results:

Translation to come 

Nous avons complété deux études comparant les embryons produits dans différentes conditions in vitro. Les résultats démontrent que dans l’ensemble, les embryons in vitro sur-expriment une série de gènes impliqués dans toutes sortes de voies métaboliques, dont notamment celle de la synthèse protéique qui est particulièrement affectée, comparativement aux embryons in vivo. Ceci vient corroborer l’hypothèse de l’embryon « silencieux » proposée par le Dr Henry Leese qui stipule qu’un bon embryon est métaboliquement peu actif. Avec surprise, nous avons remarqué que les conditions contrôles dont nous savions stressantes résultent en des embryons dont le transcriptome s’apparente davantage aux embryons in vivo que les embryons produits dans des conditions maximisant le rendement embryonnaire. Nous proposons que des conditions astringentes peuvent conduire à l’élimination des embryons moins compétents menant à une cohorte embryonnaire moins nombreuse, plus homogène et composée des meilleurs embryons. À l’inverse, les conditions maximisant le rendement embryonnaire permettent aux embryons moins compétents de survivre et de se maintenir dans la cohorte.

Ces comparaisons ont également permis de mettre en évidence que les ARNlinc sont profondément influencés par les conditions de production embryonnaire. Étant donné que ces ARNlinc se trouvent dans des régions de la chromatine que nous croyons normalement méthylées, nous nous demandons si l’expression de ces ARNlinc représente une cause ou une conséquence de l’état de méthylation de l’ADN. En d’autres mots, est-ce que ces ARNlinc sont impliqués dans l’établissement de la méthylation de l’ADN dans les blastomère en voie de différentiation ou est-ce que leur expression représente un état aberrant d’hypométhylation de la chromatine rendant permissif l’expression de ces longs ARN non-codants ?

D’un point de vue technique, l’étude de l’expression génique ou plutôt de l’abondance d’ARN durant le développement précoce comporte plusieurs défis méthodologiques alors que nous traitons des échantillons peu abondants et que la comparaison inter-stades développementaux demande de prendre en compte que le nombre de cellules, leur taille, leurs contenus en protéines et en ARN sont drastiquement différents. Peu d’équipes se sont penchées sur ces questions importantes et difficiles à répondre. Au cours des dernières années, nous avons développé plusieurs méthodes permettant de pallier à ces problèmes récurrents. Nous avons notamment développé une méthode permettant d’isoler les ARNm trouvés sur les fractions polyribosomales et ce, à partir de 75 ovocytes/embryons précoces. Ceci nous permet maintenant de concentrer nos efforts sur la sous-population d’ARNm qui est potentiellement active et d’éviter de mesurer l’ensemble des ARNm incluant ceux qui sont stockés et ceux qui sont en transit en direction vers la dégradation.

Nous avons clairement démontré que d’ignorer ces différences naturelles entre les stades développementaux induis des biais importants dans les résultats alors que dans certains cas, plus de 80% des valeurs d’abondance d’ARN sont erronées. En complément, nous avons développé une méthodologie permettant de conserver cette représentation naturelle permettant ainsi d’effectuer des comparaisons inter-stades en générant des données non-biaisées reflétant l’état physiologique à l’étude. Nous avons également validé l’ensemble des procédés conduisant à la production de données de biopuces et par le fait même, démontré l’incompatibilité des différentes méthodes utilisées pour traiter les échantillons. Ces conclusions s’appliquent également aux approches de RNAseq. Nous appliquons présentement ces développements technologiques pour étudier différentes facettes du développement embryonnaire précoce.

 

Laboratory members:

Name

Position

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Sara Scantland

PhD student

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Angus Macaulay

PhD student

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Luis-Manuel Baldoceda-Baldeon

PhD student

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Dominic Gagné

Research Professionnal

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 Habib A. Shojaei Saadi

PhD student 

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List of Publications:

Plourde D, Vigneault C, Lemay A, Breton L, Gagné D, Laflamme I, Blondin P, Robert C. (2012) Contribution of oocyte source and culture conditions to phenotypic and transcriptomic variation in commercially produced bovine blastocysts. Theriogenology. 78(1):116-31.

Plourde D, Vigneault C, Laflamme I, Blondin P, Robert C. (2012) Cellular and molecular characterization of the impact of laboratory setup on bovine in vitro embryo production. Theriogenology. 77(9):1767-78.

Macaulay A, Scantland S, Robert C. (2011) RNA Processing During Early Embryogenesis: Managing Storage, Utilization and Destruction. The chapter is part of “RNA Processing” (Intech Open Access Publisher).  

Côté I, Vigneault C, Laflamme I, Laquerre J, Fournier E, Gilbert I, Scantland S, Gagné D, Blondin P, Robert C. (2011) Comprehensive across production systems assessment of the impact of in vitro micro-environment on the expression of messengers and long non-coding RNAs in the bovine blastocyst. Reproduction. (E-Pub)

Scantland S, Grenon JP, Desrochers MH, Sirard MA, Khandjian EW, Robert C (2011) Method to isolate polyribosomal mRNA from scarce samples such as mammalian oocytes and early embryos. BMC Dev. Biol. 11:8.

Robert C., Watson AJ, Sirard MA (2011) Analysis of the Embryonic Transcriptome. The chapter is part of “Human Assisted Reproductive Technology: Future Trends in Laboratory and Clinical Practice” (Cambridge University Press).

Robert C. (2011) Recent advances in animal biotechnology: from genome to gene function. The chapter is part of the book: Comprehensive Biotechnology. (Pergamon Press, Oxford).

Robert C. (2010) Microarray analysis of gene expression during early development: a cautionary overview. Reproduction. 140(6):787-801.

Seli E, Robert C, Sirard MA. (2010) OMICS in assisted reproduction: possibilities and pitfalls. Mol Hum Reprod. 16(8):513-30.

Gilbert I., Scantland S., Sylvestre EL., Dufort I., Sirard MA, Robert C. (2010) Providing a stable methodological basis for relative transcript abundance comparisons of pre-hatching development stages using microarrays. Mol Hum Reprod. 16(8):601-16.

Gilbert I, Scantland S,DufortI,Gordynska O, Labbe A, Sirard MA, Robert C. (2009)Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation. Nucleic Acids Res. 37(8):e65

Gilbert I., Scantland S., Gravel C., Laflamme I., Sirard MA., Robert C. (2009) The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development. Mol Reprod Dev. 76(8):762-72

Robert C. (2008)Challenges of functional genomics applied to farm animal gametes and pre-hatching embryos. Theriogenology 70: 1277-1287.

Gilbert I, Bissonnette N, Boissonneault G, Vallée M, Robert C. (2007) A molecular analysis of the population of mRNA in bovine spermatozoa. Reproduction133:1073-1086.

Vigneault C, Gilbert I, Sirard MA, Robert C. (2007) Using the histoneH2a transcript as an endogenous standard to study relative transcript abundance during bovine early development. Mol Reprod Dev. 74(6):703-715.